В молодости Самойлович получил хорошее по тому времени образование. Начав служить в казацком войске, он был сотником Гадячского полка в г. Веприке, затем в звании войскового товарища и полковника возглавил Черниговский полк.
Самойлович был одним из деятельных участников переворота, задуманного Иваном Брюховецким против московской власти, но после падения гетмана и удаления П.Д. Дорошенко с левой стороны Днепра примкнул к Демьяну Многогрешному, присягнув на верность Москве, был прощен и избран генеральным судьей (1669—1672). Способствуя гибели Многогрешного, стал его преемником, избранным на раде в Конотопе в 1672. В первый период своего гетманства Самойлович вынужден был вести упорную борьбу с гетманом Правобережной Украины Петром Дорошенко. Кроме того, на правой же стороне был его соперник — поставленный поляками гетман Николай Ханенко. В 1674 вместе с Г. Г. Ромодановским он двинулся на левую сторону Днепра. В том же году в г. Переяславе состоялась рада, на которую собрались многие отпавшие от Дорошенко правобережные старшины и значные казаки; Ханенко сложил с себя звание гетмана, и на раде в 1674 правобережным гетманом был избран Самойлович, но борьба с Дорошенко еще продолжалась, пока он сам не сложил с себя гетманства в 1676. Во второй период гетману приходилось вести постоянные войны с турками и татарами с помощью и гл. обр. при настоянии московского правительства. В 1677 правобережным гетманом Турция провозгласила Юрия Хмельницкого. Посланное к Чигирину турецко-татарское войско вынуждено было отступить перед соединенными силами Самойловича и Г. Г. Ромодановского, но в следующем году опять появилось около Чигирина. Разбитые теми же войсками 5 авг. 1678, турки, однако, не были оттеснены от Чигирина, т. к. Ромодановский не оказал помощи осажденным; Чигирин был сожжен, что соответствовало тайным планам московского правительства. Победа казаков не принесла Малороссии существенной пользы. Поход Юрия Хмельницкого в 1679 был неудачен. После изгнания его из Левобережной Украины Самойлович, по воле московского правительства и совета старшин, решил истребить поселения и города в Правобережной Украине и выселить оттуда на левую сторону остаток населения. Сын гетмана Семен был послан на правую сторону с войском и уничтожил поселения, а жители были согнаны на левый берег Днепра, в Слободскую Украину. Попытка гетмана подчинить харьковский, ахтырский, сумской и острогорский полки и поселения малороссиян в Слободской Украине окончилась неудачей — они остались в подчинении Белогородского приказа и в ведении бояр и воевод Белогородского разряда, что было на руку московскому правительству. Под конец своего гетманства Самойлович разошелся в своих планах и намерениях с Москвой: он указывал на желательность отнятия у Польши и присоединения к Московскому государству исконно православных русских земель — Подолии, Волыни, Подляшья, Подгорья и всей Червоной Руси, а Москва стремилась заключить вечный мир с Польшей и начать войну с Турцией. Проводником этой политики был всесильный В. В. Голицын, благодаря которому в 1686 и был заключен договор с Польшей. Предпринятый в следующем году поход Голицына вместе с Самойловичем в Крым был неудачным. Самойлович к тому времени не пользовался в Малороссии популярностью. Он после низложения Дорошенко стал держать себя не только с народом, но и со знатными людьми как самодержавный деспот. Кроме того, стяжательность и алчность гетмана и его сыновей не знали никаких пределов. Народ был недоволен введением им оранд (аренд), или откупов, на вино, деготь, табак и налога за помол с мельниц и т. п. Но главной причиной падения Самойловича явилось охлаждение к нему московской власти. Старшина, руководимая Мазепой, послала в Москву донос с обвинением гетмана в измене. Самойлович был арестован и отправлен в ссылку сначала в Орел, потом в Н. Новгород, а затем в Тобольск, где и умер. Сын его Яков, сосланный сначала в Енисейск, умер в Тобольске в 1695, другой сын Григорий, обвиненный в непочтительных отзывах о московских правителях, был подвергнут пыткам и казнен в 1687.