Стюарт окончил военно-морскую академию в Шотландии по специальности "гражданский инженер". К счастью для Австралии он считал себя непригодным к военной службе со своим ростом 165 см и весом меньше 50 кг.
Заинтересованный услышанными им историями о колонии Новый Южный Уэльс, в 1839 году он иммигрировал туда и на первых порах работал землемером. Возможно именно эта профессия привила Стюарту любовь у удаленным малонаселенным местностям Австралии. Позже Джон начал заниматься фермерством, а в 1844 году примкнул к экспедиции Стерта в центральную часть страны, которая продлилась 17 месяцев.
По возвращении Стюарт 12 лет работал с недвижимостью. Однако к 1858 году "зов пустыни" стал невыносимым. Вместе с охотником-аборигеном и еще одним спутником Стюарт исследовал территорию к северу от Аделаиды до Стрики-Бей. Он был награжден медалью Королевского Географического общества за преодоление тяжелейших 1200 км по неисследованному бушу. Однако трудности этой экспедиции лишь раззадорили страсть Стюарта к исследованиям. На следующий год он совершил еще две геодезические экспедиции по исследованию разведанного им района.
В марте 1860 года Стюарт совершил первое из двух своих наиболее выдающихся путешествий. Он с двумя попутчиками на 13 лошадях достигли географического центра Австралийского континента. Выдержав нападения аборигенов, голодая и испытывая жажду, экспедиция в полном составе возвратилась в Аделаиду.