Наиболее известен своими новаторскими трудами по генетическим основам эволюции и мутагенезу, а также по биохимии и биометрии.
Родился 3 мая 1860 в Эдинбурге. Учился в Эдинбургской академии, в Эдинбургском и Йенском университетах. В 1884 получил степень доктора медицины. С 1887 работал на кафедре физиологии Оксфордского университета – ассистентом, а затем профессором. В 1897 был избран членом Лондонского королевского общества, в 1905 – членом совета Нью-колледжа Оксфордского университета. Руководил физиологическими лабораториями в Донкастере (с 1912) и Бирмингеме (с 1921).
Холдейн – один из создателей учения о дыхании человека, о его регуляции и роли в этом процессе углекислого газа. Ученый исследовал токсическое действие окиси углерода, разработал методы борьбы с отравлением этим газом. Впервые определил состав альвеолярного воздуха у человека с помощью созданного им газоаналитического аппарата (аппарат Холдейна). В 1911 возглавил высокогорную экспедицию на пик Пайкс (шт. Колорадо), положившую начало исследованиям по приспособлению организма к экстремальным условиям. Занимался вопросами охраны труда шахтеров, изучал влияние влажности воздуха на переносимость организмом высоких температур. Исследовал взаимодействие между дыханием и кровообращением, определял минутный объем при мышечной деятельности. Разработал новый метод декомпрессии, создал основы профилактики кессонной болезни. В 1933 участвовал в создании и испытании первого высотного скафандра. Результаты своей научной деятельности Холдейн обобщил в книге Дыхание (Respiration, 1935), которую написал на основе лекций, прочитанных в Йельском университете. Среди других его трудов – Методы анализа воздуха (Methods of Air Analysis, 1912; 2-е изд. совместно с И.Грэхемом, 1934); Организм и окружающая среда на примере физиологии дыхания (Organism and Environment as Illustrated by the Physiology of Breathing, 1917); Новая физиология (The New Physiology, 1919); Философские основы биологии (The Philosophical Basis of Biology, 1931).
Умер Холдейн в Оксфорде 15 марта 1936.