Училась в Рэдклифском колледже, занималась психологией у Уильяма Джемса, затем изучала медицину в университете Джона Хопкинса.
С 1902 года она жила в Европе. В период между мировыми войнами ее парижская квартира превратилась в художественно-литературный салон.
Друзьями Гертруды Стайн были Пабло Пикассо и Анри Матисс, Эрнест Хемингуэй и Фрэнсис Скотт Фицджеральд, гостями ее салона были многие американские писатели "потерянного поколения". (Именно Стайн принадлежит авторство этого названия).
За дебютной повестью "Три жизни", вышедшей в 1909 году, последовал роман "Становление американцев" (опубликован в 1925 году).
В 1914 году была создана серия словесных "портретов" - "кубистских" воплощений предметов, еды и помещений – "Нежные кнопки". Широкую известность – не только в кругу авангардистов – принесла Гертруде Стайн "Автобиография Алисы Б.Токлас" (1933).
После успеха этой книги писательница совершила поездку по США с лекциями, в Нью-Йорке была поставлена ее опера "Четверо святых в трех актах".
Перу Гетруды Стайн также принадлежат книги "Войны, которые я видела", "Брюси и Уилли", пьеса "Очень молодой человек говорит 'да'", а также стихи.
Умерла Гертруда Стайн 27 июля 1946 года в Париже.